Voidaanko proteiinien valmistumista mikrobeissa seurata reaaliaikaisesti?
Vasta-aineet ovat tärkeä osa muun muassa immuunipuolustustamme ja niitä voidaan tuottaa bioteknologian menetelmillä laboratoriossa. Tutkijat selvittivät, voiko vasta-aineiden tuottumista seurata samanaikaisesti kuin niitä mikrobeissa valmistuu ja miten seuranta onnistuisi.
Johdanto
Proteiinit eli valkuaisaineet ovat tärkeä osa tasapainoista ruokavaliota, mutta ennen kaikkea ne ovat elämälle välttämättömiä molekyylejä, joita elävät olennot tuottavat ja hajottavat jatkuvasti osana elintoimintojaan. Proteiinit ovat bioteknologisen tutkimuksen kannalta erittäin merkittävä molekyyliryhmä, koska niitä voidaan soveltaa monella tavalla. Muun muassa kolmasosa uusista lääkkeistä on biologisia lääkkeitä, joista lähes kaikki ovat proteiineja, erityisesti vasta-aineita. Vasta-aineet ovat nisäkkäiden immuunipuolustusjärjestelmän molekyylejä.1
Vasta-aineita voidaan bioteknologian keinoin tuottaa sekä nisäkässoluissa että mikrobeissa kuten E. coli -bakteereissa. Kun halutaan tuottaa vasta-ainetta kolibakteerissa, vasta-aineproteiinia koodaava geeni liitetään ensin plasmidiin, joka puolestaan siirretään bakteeriin. Plasmidi on pieni rengasmainen DNA-molekyyli, joita bakteerit käyttävät luonnostaan geenien siirtoon. Bakteeri valmistaa plasmidiin lisätyn geenin ohjeen mukaan lähetti-RNA:ta, jonka sisältämän tiedon perusteella bakteeri tuottaa puolestaan vasta-aineproteiinia. Seuraavassa vasta-aineen tuottovaiheessa bakteereita kasvatetaan bioreaktorissa eli terästankissa, jossa on automatisoitu lämpötilan säätö, sekoitus ja ilmastus, joka tarkoittaa suodatetun paineilman puhaltamista nesteeseen. Näillä bioreaktorin säädöillä pyritään varmistamaan happipitoiset ja kasvulle suotuisat olosuhteet.
Vasta-ainemolekyylejä ei voida havaita tuottovaiheen aikana vaan vasta erityisillä biokemiallisilla menetelmillä tuoton ja puhdistuksen jälkeen, jolloin vasta-aine on erotettu eli puhdistettu muista solujen tuottamista proteiineista. Tämä on ongelma kasvatusvaiheessa, koska jos kasvatus lopetetaan liian aikaisin, se vähentää saatavan vasta-aineen määrää, mutta liian myöhäinen lopetus taas johtaa turhaan odotteluun ja proteiinin mahdolliseen vuotamiseen soluista ulos. Lähdimme siis pohtimaan, olisiko mahdollista kehittää menetelmä, jolla voidaan seurata vasta-aineiden tuottumista reaaliaikaisesti eli samanaikaisesti kuin niitä mikrobeissa valmistuu? Näin meillä olisi mahdollisuus kerätä vasta-ainepotti talteen oikea-aikaisesti ja parantaa kerätyn tiedon perusteella kasvatusprosessia siten, että vasta-ainetta saataisiin tuotettua seuraavassa kokeessa vieläkin enemmän.
Miten tutkimus tehtiin?
Keksimme ratkaisun, jolla voimme seurata vasta-aineen tuottumista reaaliaikaisesti. Vasta-aineen tuottuminen kytkettiin vihreän fluoresoivan proteiinin (engl. green fluorescent protein) eli GFP:n tuottumiseen. GFP on Aequorea victoria -meduusasta alun perin peräisin oleva proteiini, joka laskostuttuaan kolmiulotteiseen rakenteeseensa virittyy sinisellä valolla ja viritystilan purkautuessa lähettää vihreää valoa.2 GFP:n voi havaita paljain silminkin, mutta pystyäksemme havainnoimaan ja mittaamaan GFP:n pieniä pitoisuuksia tarkasti sameasta bakteerikasvatusliuoksesta, meidän piti rakentaa fluoresenssin mittaamiseen suunniteltu mittalaitteisto. Näin voimme verrata eri bakteerinkasvatuskokeita toisiinsa varman tiedon pohjalta sen sijaan, että arvioisimme tuottuneen GFP:n ja siten vasta-aineen määrää silmämääräisesti. Lisäsimme GFP-geenin samaan plasmidiin vasta-aineproteiinia koodaavan geenin kanssa. Geenien tuottumista plasmidissa säätelee promootteri. Promootteri on pala DNA:ta, joka ohjaa geenin aktiivisuutta. Siksi suunnittelimme GFP-geenin yhteyteen promootterin, joka oli samanlainen kuin vasta-ainegeenin promootteri. Näin valmistettu reportteriplasmidi tuottaa samanaikaisesti sekä vasta-ainetta että GFP:tä.
GFP:tä voidaan mitata vihreän fluoresenssin perusteella. Kun GFP:tä sisältävää näytettä valaistaan sinisellä valolla, GFP-molekyylit virittyvät ja viritys purkautuu vihreänä valona (Kuva 1). Rakensimme GFP:n mittaamiseen oman laitteiston, joka käyttää sinistä lediä valonlähteenä ja kameraa fluoresenssin havaitsemiseksi.
Mittausaseman kamera suunniteltiin ottamaan säännöllisin väliajoin kuvia kasvatusnäytteestä. Koska GFP lähettää vihreää valoa, suunnittelemamme mittausasema analysoi ja summasi valokuvista vihreiden pikseleiden lukuarvot eli määrän. Lukuarvojen summa on suoraan verrannollinen GFP:n fluoresenssin määrään. Saimme jokaisen analyysin jälkeen kuvaajan tietokoneen näytölle, joka kertoi reaaliaikaisesti, miten vihreä fluoresenssisignaali eli GFP-signaali nousi suhteessa kuluneeseen aikaan.
Koska mittausasema on oma, bioreaktorista erillinen yksikkönsä, meidän oli suunniteltava myös se, miten bakteeriviljelynäyte saadaan toimitettua mittauspisteelle. Niinpä suunnittelimme ohivirtausjärjestelmän, jossa peristalttipumpun avulla ohjattiin pieni nestevirtaus letkua pitkin bioreaktorista mittausasemalle ja sieltä takaisin reaktoriin (Kuva 2). Tässä ohivirtausjärjestelmän kehittämisessä oli tärkeä ottaa huomioon, että se olisi steriloitavissa, jolloin emme pilaisi kolibakteeriviljelmäämme muilla ympäristössä kasvavilla mikro-organismeilla. Päädyimme silikoniletkujen ja lasiputken yhdistelmään, jolle voitiin suorittaa sterilointikäsittely autoklaavaamalla, missä välineet kuumennetaan vähintään 121 C°:een lämpötilaan vähintään 20 minuutiksi.
Vasta-ainetuotto ja samalla GFP-tuotto käynnistettiin siten, että laitoimme kasvatukseen promootterin aktiivisuutta voimakkaasti lisäävää yhdistettä eli indusoria. Mittasimme kokeiden aikana GFP-signaalia mittalaitteellamme ja keräsimme säännöllisesti näytteitä kasvatuksesta (mittalaitteen rakenne kuvassa 3). Analysoimme näytteet myöhemmin laboratoriomenetelmillä, joilla pystyimme mittaamaan vasta-aineen määrän ja vertasimme saatuja tuloksia GFP-signaaliin ajan suhteen.
Mitä tutkimuksessa löydettiin?
Merkittävin tulos oli, että GFP-fluoresenssi korreloi vahvasti tuotetun vasta-aineen määrän kanssa. Tämä tarkoittaa, että GFP-signaalia voidaan käyttää luotettavana välillisenä mittarina vasta-aineen tuottumiselle. Lisäksi GFP-proteiinin tuottumista onnistuttiin mittaamaan reaaliaikaisesti kehittämällämme mittalaitteistolla. Lämpötila vaikuttaa proteiinin tuottumisnopeuteen. Valitsemallamme 30 C°:een tuottolämpötilalla GFP:n määrä kaksinkertaistui noin tunnissa. Pitkäkestoisimmissa bioreaktorituottokokeissa havaitsimme, että seuraamalla GFP-signaalin muutosnopeutta pystyimme luotettavasti määrittämään, milloin meidän kannatti lopettaa kasvatus. Kun GFP-signaalin kasvu alkoi merkittävästi hidastumaan, tiesimme että kasvatuksen voisi lopettaa ja vasta-aineen puhdistuksen aloittaa. Ylimääräinen kasvatusaika johtaisi vain vasta-aineen karkaamiseen kasvatusliuokseen.
Kun teimme tuottokokeita eri olosuhteissa, oivalsimme, että GFP-signaalin avulla pystyimme myös päättelemään, oliko promootteri aktivoitunut hyvin. Indusorin läsnäollessa signaali kasvoi yhdeksänkertaisesti, mutta ilman indusoria signaali kasvoi merkittävästi vähemmän, vain kaksinkertaisesti. Menetelmällä saatua tietoa voidaan siis käyttää myös ratkaisemaan se, kannattaako tuottokasvatuksen kanssa edetä aikaa vievään puhdistusvaiheeseen vai olisiko järkevämpää tuottaa vasta-ainetta uudelleen. Mielenkiintoisesti kokeissamme GFP-signaalia saatiin ilman, että lisäsimme indusoria. Tutkittuamme asiaan liittyvää kirjallisuutta ymmärsimme, että pieni promootterin aktiivisuus ilman indusorin lisäystä on hyvin tunnettu käyttämämme laktoosipromootterin ominaisuus.3
Lopuksi
Kehittämämme reportteriplasmidi ja mittausasema mahdollistivat reaaliaikaisen proteiinin tuottumisen seuraamisen vihreän valon määrän perusteella. Tätä teknologiaa voidaan käyttää hyväksi, kun halutaan edistää vasta-aineen tuottoprosessia bioreaktorissa. Tutkimuksessa laitteiston rakentamisessa hyödynsimme yleisesti ja edullisesti saatavilla olevia teknologioita. Nämä muodostavat tehokkaan työkalupaketin monenlaisten tee-se-itse-projektien toteutukseen erittäin pienillä kustannuksilla.